انتقال الفيروسات بواسطة الحشرات Insect transmission

الانتقال بواسطة الحشرات Insect transmission

تلعب  الحشرات دوراً مهماً في نقل معظم الفيروسات النباتية وانتشارها في الحقول، وأهمها حشرات المن Aphidida تليها نطاطات الأوراق  Cicadellidae ثم نطاطات النبات Delphacidae ونطاطات الأشجارMembracidae والذبابة البيضاء Aleyrodidae والخنافسColeoptera   والتربسThysanoptera  والبق  Pseudococcidae والحلم  Acarina…وغيرها.

وتعتمد دراسة انتقال الفيروسات بواسطة الحشرات، على معرفة نوع العلاقة بين الفيروس والحشرة الناقلة له، وتتطلب القيام بالخطوات التالية:

  1. جمع الحشرات من الحقل:

تجمع الحشرات المختلفة من الحقول بعدة طرائق،أهمها:

1.1. بواسطة شباك تمرر فوق المجموع الخضري للنبات.

2.1. بواسطة هز النبات أو طرقه وتجمع الحشرات الساقطة على قطعة قماش توضع أسفله.

3.1. بواسطة فرشاة رسم بصورة فردية.

4.1. بواسطة جمع النباتات التي تحتوي على الحشرات.

5.1. اصطياد الحشرات، بواسطة المصائد الحشرية المختلفة:

1. المصائد اللونية: تجمع حشرات المن والذباب الأبيض بواسطة وعاء أصفر مملوء بالماء.

2. المصائد الضوئية: تنجذب معظم الحشرات للأشعة الزرقاء وفوق البنفسجية.

3. المصائد الشافطة: تشفط الحشرات بواسطة تيار هوائي.

4. المصائد اللاصقة: تجذب الحشرات للأسطح الملونة والمغطاة بمادة لاصقة.

  1. 2.                 تربية مســتعمرات نقية للحشرات:

يجب التعرف على الحشرات المجموعة من الحقل، وهل تكون حاملة أم غير حاملة للفيروس، وذلك بوضعها على عوائل دالة قابلة للإصابة بالفيروس، ثم تؤخذ الحشرات السليمة وتربى  على عوائل غير قابلة للإصابة بالفيروس، أو يمكن انتظار الحشرات الحاملة للفيروس، حتى تضع بيضها على عوائل غير قابلة للإصابة بالفيروس، ولا تفيد هذه الطريقة في الفيروسات التي تنتقل بواسطة بيض الحشرات إلى نسلها.

تؤسس مســتعمرات نقية للحشرات بدءاً من حشــرة واحدة حديثة الولادة من الحشرات البالغة غير المجنحة ( الأمهات) سواء كانت حاملة للفيروس أو خالية منه، بطريقتين:

 

  1. 1.                التغذية على وسط غذائي:

 تتم بتغذية حشرات المن البالغة( الأمهات) حسب طريقـة (Johnston et al.,1984) على وسط غذائي مكون من %20 سكروز في ماء مقطر داخل طبق بتري مغطى بغشاء مزدوج من البارافيلم، وضعت بينهما قطرات من المحلول السكري، ثم تنقل الحشرات الحديثة الولادة (الحوريات) إلى نباتات سليمة بمرحلة البادرة والمزروعة في أصص، وتحجز تحت أقفاص أسطوانية بلاستيكية مزودة بفتحات جانبية ومغطاة بنسيج شـبكي يسمح بالتهوية، أو داخل أقفاص خشبية خاصة، ضمن الدفيئة الزجاجية عند درجة حرارة تراوحت بين 10ْ س ليلاً و 25ْ س نهاراً في فصل الشتاء، وبين 10ْ س ليلاً و30 ْ س نهاراً في فصل الصيف، كما تراوحت الرطوبة النسبية بين % 85-70 .

  1. 3.                التغذية على أوراق عوائل غير قابلة للإصابة:

تغذى حشرات المن البالغة على الأوراق الحديثة أو القمية لعائل نباتي سليم، موجودة في طبق بلاستيكي صغيرة، ذو غطاء مثقب ومغطى بشاش للتهوية، ويوجد في أسفلها ورقة نشاف رطبة ، ثم تحفظ العلب في حاضنة عند حرارة 15-20ْس لكي تتوالد الأمهات وتعطي حوريات، ثم تنقل بدورها إلى نباتات سليمة بمرحلة البادرة والمزروعة في أصص، وتحجز تحت أقفاص أسطوانية بلاستيكية مزودة بفتحات جانبية ومغطاة بنسيج شـبكي يسمح بالتهوية، أو داخل أقفاص خشبية خاصة، ضمن الدفيئة الزجاجية وتحت نفس الظروف السابقة.

  1. إلقاح النباتات بواسطة حشرات حاملة للفيروس:

تدرس كفاءة أنواع الحشرات في نقلها للفيروس، حيث تغذى الحشرات البالغة على أوراق نباتات مصابة بالفيروس المدروس، لحين اكتسابها له ( فترة الاكتساب Acquisition period وهي  الفترة الزمنية التي تحتاجها الحشرة الناقلة لاكتساب الفيروس)، وتتراوح بين بضعة ثوان إلى ساعات قليلة، تنقل بعدها الحشرات المغذاة والحاملة للفيروس بواسطة فرشاة ناعمة إلى نباتات سليمة يراد نقل الفيروس إليها، وهي بطور البادرة 3-4 أوراق مزروعة في أصص بلاستيكية لإجراء العدوى لها( فترة الانتقال Transmission period أو فترة الحقن Inoculation period )، ثم تعزل النباتات الملقحة تحت أقفاص بلاستيكية وضمن البيت الزجاجي، وترش بعد 48 سـاعة من الإلـقاح بمبيد حشري جهازي، للتخلص من الحشرات بعد فترة الانتقال أو الحقن اللازمة لنقل الفيروس.

وجد أن بعض الحشرات تنقل الفيروس إلى النبات السليم مباشرة بعد اكتسابه، بينما تنقله حشرات أخرى بعد فترة حضانة Latent period (تحدد مدتها من فترة اكتساب الغذاء وحتى تصبح الحشرة قادرة على إصابة النبات بالفيروس) تتراوح بين بضعة ساعات إلى عدة أسابيع، وتتم دراستها بتغذية الحشرات الحاملة للفيروس على النباتات السليمة على فترات منتظمة بعد اكتسابها له.

 تحتفظ حشرات المن بقدرتها على نقل الفيروس المحمول على رمحها Stylet لمدة نصف ساعة، بينما تحتفظ نطاطات الأوراق وبعض أنواع المن بقدرتها على نقل الفيروس الموجود  في جهازها الهضمي طوال حياتها، وتنقل أنواع المن الأخرى الفيروس الموجود في جهازها الدوري Haemolymph  طوال حياتها حتى بعد انسلاخها.

5. تقدير كفاءة الحشرات الحاملة للفيروس:

 تقدر كفاءة الحشرات في نقل الفيروس المدروس، بفحص النباتات المعداة بعد مرور عدة أيام على العدوى، بأحد ى طرائق الاختبارات المصلية، أو بمراقبة ظهور أعراض الإصابة عليها لمدة 4- 8 أسابيع، وتترك بعض النباتات غير معدية بالفيروس كشاهد للمقارنة في نفس الدفيئة الزجاجية، للتأكد من خلو النباتات المدروسة من الفيروس قبل إلقاحها، و يجب التأكد من خلو الحشرات المجموعة من الفيروس، عن طريق نقلها إلى نباتات سليمة وتغذيتها، وملاحظة الأضرار التي تسببها التغذية.

 ويتم إكثار أنواع الحشرات الأكثر كفاءة في نقل الفيروس ضمن بيت بلاستيكي 25 -15  ْس، لاستعمالها في عمليات العدوى اللاحقة.

6. التجهيزات اللازمة :

تحتاج اختبارات نقل الفيروسات بواسطة الحشرات إلى التجهيزات والأدوات التالية:

1.6. الأقفاص Cages:

هي عبارة عن حيز محدود ومجهز بطريقة تسمح بالمحافظة على الكائنات الحية بداخله، وتستخدم عدة أنواع منها في دراسات الانتقال الحشري للفيروسات، وأهمها:

1.1.6. الأقفاص الخشبية Wooden plant cages:

تكون بأبعاد تتراوح 35 X 35 X 50 سم، وتغطى جوانبها بشاش ذو أبعاد دقيقة، وقمتها وقاعدتها بالزجاج، وتستخدم أقفاص ذات جانبين خشبيين بكل منهما فتحة دائرية قطرها 18 سم تسمح بدخول اليد من خلالها، وتغطى الفتحتين بأنبوبة قماشية سوداء، تغلق من طرفها البعيد برباط مطاطي، لمنع هروب الذبابة البيضاء منها.

2.1.6. الأقفاص البلاستيكية الأسطوانية Plastic cylinder whole plant cage:

تغطى قمة أسطوانة بلاستيكية شفافة قطرها 32 سم بالشاش، وتثبيت قاعدتها في أصيص ينمو فيه النبات المدروس، ويمكن أن توضع داخل الأسطوانة أوراق طازجة تغمر قواعد أعناقها في أنابيب بها ماء.

3.1.6. الأقفاص الورقية الأسطوانية البلاستيكية Plastic cylinder leaf cage:

تستخدم عند اختبار عدد محدود من الحشرات، ويصنع القفص من جزأين من أنابيب بلاستيكية طولها 1.5 سم وقطرها 3 سم، وتغطى الأنبوبة من أحد جوانبها بقماش من النايلون، وتدخل الحشرات فيها، من خلال فتحة صغيرة تعمل في الجانب الأخر، وتُغْلَق بسدادة فلينية.

يثبت جوانب الأنبوبتين حول الأوراق بواسطة مشبك شعر عادي، مع تثبيت نهايتي المشبك الحرتين في جزأي الأنبوبة بتسخينهما، ثم دفعهما في الجدار البلاستيكي.

 

2.6. الأوعية البلاستيكية أو الزجاجية Plastic or glass containers:

تستخدم في نقل الحشرات التي جمعت من الحقل، وتغطى بغطاء شبكي، ويجب أن تكون الأوعية واسعة، لكي تسمح بالتهوية الجيدة.

3.6. فراشي رسم:

تستخدم عند تناول حشرات المن بعد ترطيب طرفها، لكي تساعد على التصاق الحشرة بها.

4.6. جهاز شفط Asirator:

يستخدم مع الحشرات النشيطة في حركتها، كنطاطات الأوراق والذباب الأبيض، ويتكون من أنبوبة اختبار صغيرة مغلقة بسدادة مطاطية ذات فتحتين، تمر من إحداها أنبوبة زجاجية صغيرة مستقيمة يتصل طرفها الخارجي بأنبوبة مطاطية تستعمل للشفط، بينما يغطى طرفها الداخلي بسدادة من الحرير أو النايلون، تسمح بسحب الهواء بحرية تامة وتمنع مرور الحشرات، ويمر من الفتحة الأخرى للسدادة المطاطية أنبوبة زجاجية أطول قليلاً، ذات طرف خارجي ملتو قليلاً ليسمح بالتقاط الحشرات بكفاءة عالية عند شفطها.

5.6. شعيرات مفردة:

 تربط هذه الشعيرات في أعواد خشبية صغيرة ( منظفات الأسنان الخشبية)، وتستخدم في التقاط الحشرات الصغيرة كالمن والتربس.

 

خطوات نقل الفيروسات بواسطة الفطور

1. العزل:

بعد تلقينا دلالة على وجود الناقل الفطري في النباتات المريضة، نقوم بجمع عينات التربة ونستخدم النباتات الصائدة لالتقاط كل من الفيروس والناقل الفطري المحتمل، وإن إجراءات جمع عينات التربة هي نفسها التي تمّ استعراضها في حالة اختبارات النقل بواسطة النيماتودا، ومن الأفضل جمع عينات التربة من المناطق المتركزة حول جذور النباتات المتأثرة، وعادة يتم مزج عينات التربة مع الرمل المعقم ثم تعبأ في أوعية معقمة.

في العادة يكون تلوث التربة كبيراً إذا تم جمع عينات التربة بعد شتاء قاسٍ، و/ أو بعد هواء جاف، وقبل إجراء الاختبارات فأنه يجب علينا زيادة معدل تحرر الأبواغ من الأجسام الساكنة، وعادة تكون النباتات المتأثرة تحت  الظروف الحقلية هي نفسها التي تستخدم بالاختبارات تحت البيت الزجاجي، ومن الأفضل تنمية النباتات من البذور لنتجنب وجود جذور متضررة أثناء عملية نقل النباتات.

2. المحافظة على زراعات العامل الفطري الناقل:

إن عزل أنواع النواقل المتخصصة ( أو غير النواقل ) ودراسة صفاتها هو أمر على غاية من الصعوبة ويتطلب العديد من التطبيقات المختلفة، وإحدى هذه التطبيقات هي المحافظة على الزراعات الفطرية عند درجات حرارة مختلفة من أجل أن نزيل أو ننقص من أفراد الكائنات الغير مرغوب بها عند درجات الحرارة الغير متاحة لنا عملياً.

هناك طرق معينة يتم إتباعها لتأسيس مزارع فطرية وتشريح قطع الجذور الخارجية عند الأنواع الفطرية المرغوبة، فمن أجل تأسيس مستعمرة للناقل الفطري خلال  3 ـ 4 أسابيع يتم إخراج أجزاء النباتات الصائدة من التربة وتستخدم لتأسيس مستعمرات إضافية، ويمكن التّعرف على الأنواع الفطرية بمساعدة علم الفطور، وكلما تم الحصول على مستعمرات فطرية يمكن أن نحافظ عليها بنقل معلق الأبواغ لبادرات صائدة حديثة .

وسط النمو للأهداف السابقة هو الرمل المعقم أو المالاشيت أو قطع زجاجية صغيرة، ويتم الحفاظ على نشاط النباتات بريها بمحلول مغذي، وعندما يتم استزراع النواقل الفطرية من النباتات المتأثرة طبيعياً فإن هذه المزرعة الفطرية قد تحتوي أيضاً على الفيروس، وإن تحرر  الفيروس من المزرعة الفطرية هو أمر ضروري لشرح طرق الانتقال الفيروسي، وقد يتم الحصول على وسط النمو من عينات التربة  المأخوذة من خارج المنطقة المريضة.

إذا كان الفيروس محمولاً على الأبواغ بشكل خارجي فإنه يمكن إبادة الفيروس بالمعاملة ببعض المواد الكيمائية مثل حمض الهيدروكلوريك، أو المنظفات،أوRibuvirin  ، أو الحضانة مع المصل المضاد للفيروس.

يمكن إجراء سلسلة متناوبة من أوساط النمو الفطرية على عدة نباتات غير عائلة للفيروس تبقى خلالها الفعالية لعدة أسابيع، وعند حصولنا على أوساط نمو فطرية فإنه يجب الحفاظ عليها كمرجع وللاستعمال المستقبلي، وإن النواقل الفطرية سهلة الحفظ لأنها تعطي أبواغ ساكنة ثابتة، وعندما يتم تخزين قطع الجذور المتأثرة بالفطور تحت ظروف الهواء الجاف والتخزين المحكم فإنها تبقى فعّالة لسنوات عديدة.

3. اختبارات النقل الفطري:

تستخدم الأبواغ بفعالية في اختبارات النقل الفطري، ويتم الحصول على المعلق البوغي من وسط نمو الناقل الفطري، يتم تدفق أبواغ الفطر Olpidium  brassica  بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق من غمر الجذور بالماء، أما بالنسبة لنواقل أخرى مثل                               Polymixa  graminis  و Spongpspora  subterranea  فإن تحرر الأبواغ يحصل بعد أن يتم الغمر بالماء وإتباعه بهواء جاف.

تفقد الأبواغ حيويتها عادةً بعد 10 – 60 دقيقة من غمرها بالماء وحتى نحافظ على حيوية الأبواغ من الأفضل استخدام أحد المحاليل التالية:

        · Knop,s   2  %

        · محلول هوجلاند  5 %

        · المنظّم الفوسفاتي 0.01   M    أو  0.05  M من الغليسرين ومصل الألبومين البقري

بعد تحضير المعلق من الأبواغ الخالية من الفيروسات يتم صبه حول الجذور النباتية التي هي مصدر للفيروس والتي تتأثر به أيضاً كان مصدره، سواءُُ كان النقل الميكانيكي أو العصارة النباتية الآتية عبر التطعيم بالقلم  والحاوية على الفيروس.

يتم جمع المعلق البوغي من جذور النباتات التي هي مصدر للفيروس ثم يستخدم في تلقيح البادرات النباتية الصائدة السليمة المزروعة في وسط النمو الخامل والمعبأ بأكياس، ويمكن مزج المعلق البوغي تحت ظروف المخبر مع تحضيرات مُسبقة من جزيئات الفيروس التي تمت تنقيتها جزئياً، أو مع عصارة الفيروس التي نستخلصها من النباتات المتأثرة، وبعد عدة ساعات يمكن إضافة هذا المزيج إلى أجزاء النباتات الصائدة السليمة.

يتم حفظ النباتات الصائدة المُلقحة لمدة 3 – 8 أسابيع عند حرارة 20 سْ، ويعتمد ذلك على الأنواع النباتية الصائدة للفيروس، بعد ذلك ننتظر تطور الأعراض الفيروسية على الأوراق  و / أو تكاثر الفيروس بالجذور.

يتم الكشف عن وجود الفيروس في جذور النباتات المعّدية وفي الأجزاء النباتية المنفصلة الأخرى، ويمكن متابعة الفيروس سواءُُ بمحـاولة إعداءه مُجدداً، أوبالطرق المصلية مثــل( ELISA )، وفي اختبارات النقل يتم دائماً معاملات للشاهد تتم عملية إعداءها كما يلي:

   · بالمعلق البوغي الخالي من الفيروس للتأكد بشكل مبدئي أنه خالٍ من الفيروس وأن العدوى الفطرية ليست سبب الأعراض المرضية.

        · بالمعلق الفيروسي بدون أبواغ فطرية لإظهار أنه لا يمكن حصول نقل للفيروس بدون وجود العامل الناقل.

        · نباتات صائدة غير معاملة و خالية من الفيروس

إن امتداد الأعراض على النباتات المعاملة يتأثر عادة بدرجات الحرارة العالية ( الأعلى من 20 سْ، وتعتبر الأعراض الفيروسية عند درجة حرارة 14  – 18 سْ هي الأعراض المثالية.

عزل السلالات الفيروسية:

يمكن عزل السلالات التابعة لفيروس ما، باتباع اختبار البقع الحلقية، وذلك بإجراء عدوى لمستخلص العصارة المعدية المأخوذة من البقع الصفراء اللون في الأوراق المصابة بالموازييك، أو من البقع الموضعية Local lesions، لأن كافة الأدلة تشير على أن كل بقعة موضعية تنشأ من جسيم واحد من الفيروس، لذلك تستخدم البقع الموضعية في عدوى نباتات تحدث بها إصابات جهازيه،  لكونها طريقة عملية في إكثار سلالات الفيروس، بحيث تكون البقع الموضعية واضحة ومحددة، وأن يتم اختيار أفضل العوائل لهذا الغرض، وقد استخدم (Smith,1977)  نبـات الـ  N. glutinosa وبعض أصناف الفاصولياء، بنجاح في عزل سلالات فيروس موازييك التبغ.

حفظ الفيروسات:

تحفظ الفيروسات النباتية بعدة طرق، وأهمها:

1-  المحافظة على الفيروسات في عوائل مناسبة بصورة دائمة، وهذه الطريقة هي الأكثر شيوعاً، وتتم في حالة العوائل غير المعمرة، بتكرار عدوى نباتات جديدة من العائل بالفيروس على فترات.

2-  حفظ الأجزاء النباتية المصابة بالفيروس في أكياس بلاستيكية عند درجة حرارة 20ْس، لكن الفيروس يفقد قدرته في إحداث الإصابة مع تكرار عمليتي تجميد وفك Thawing النسيج النباتي المصاب.

3-  تجفيف الأوراق النباتية المصابة بالفيروس بسرعة، وتخزن فوق كلوريد الكالسيوم على درجة صفر – 4ْس، ويستخدم عادةً كلوريد الكالسيوم المحبب قطره 5-15 مم، يوضع في قاع وعاء زجاجي، ثم يغطى بطبقة رقيقة من القطن أو المناشف الورقية ( كلينكس)، ويوضع عليها من 5-10 غ من الأوراق المصابة بعد تجزيئها إلى قطع صغيرة بواسطة شفرة حلاقة معقمة، ثم  يحكم إغلاق الوعاء الزجاجي بالبرافين، ولتجفيف عينة الأوراق المصابة بصورة تامة، يجب فتح الوعاء الزجاجي، واستبدال حبيبات كلوريد الكالسيوم لعدة مرات.

4-   التجفيد Freeze Drying.

About these ads

One thought on “انتقال الفيروسات بواسطة الحشرات Insect transmission

  1. Cryoglobulins 2012/04/21 الساعة 1:27 ص Reply

    Hello there. I discovered your web site by the use of Google at the same time as looking for a similar subject, your site got here up. It seems good. I’ve bookmarked it in my google bookmarks to come back later.

أضف تعليق

إملأ الحقول أدناه بالمعلومات المناسبة أو إضغط على إحدى الأيقونات لتسجيل الدخول:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. تسجيل خروج   / تغيير )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. تسجيل خروج   / تغيير )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. تسجيل خروج   / تغيير )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. تسجيل خروج   / تغيير )

Connecting to %s

تابع

Get every new post delivered to your Inbox.

%d bloggers like this: